Для исследования прошлой жизни с помощью биомолекул, в масштабе времени в миллионы лет, белки, вероятно, являются нашим лучшим ресурсом. Они присутствуют практически во всех биологических тканях, и до эпохи пластика составляли значительную часть материальной культуры, созданной человеческими обществами по всему миру. Белки сохраняются и после завершения своей биологической функции, становясь продуктами питания, текстилем, строительными материалами, красками и клеями. Остатки этих материалов и деятельности прошлого стали частью исторических и археологических записей, так же как останки людей, животных и растений интегрировались в био- и геосферу, где они могут оставаться доступными в течение длительного времени.
Хотя белки распадаются, рециркуляция азота не является полностью эффективной, и в защищённых средах (например, костях, зубах, яичной скорлупе) белки могут сохраняться миллионы лет и более. Фрагменты белков обнаруживаются в окаменелостях (например, семенах, костях), обработанных биологических останках (например, древесине, текстиле, археологических и художественных артефактах), в отложениях на кухонной утвари, а также в почве и солевых отложениях. В этом «мёртвом бассейне» содержится больше белкового азота, чем во всех живых клетках Земли. Белки, кодируемые ДНК, упаковывают тот же объём информации о последовательности примерно в одну шестую от числа атомов. Например, фрагмент ДНК имеет большую массу, чем многие интактные белки, включая β-лактоглобулин, гемоглобин и амелогенин. Сворачивание и агрегация белков дополнительно защищают их от химического воздействия и облегчают их захват. Благодаря меньшему количеству атомов, меньшему количеству химических связей и более компактной структуре, белки, следовательно, распадаются медленнее, чем ДНК. Однако более широкий спектр реактивных видов и наша ограниченная способность получать прямую информацию об их состоянии распада означают, что древние белки расширяют границы нашего понимания процессов распада и диагенетических модификаций. Тем не менее, эти результаты вряд ли можно назвать эзотерическими, поскольку модификации, связанные с древними белками, имеют значение для понимания старения и заболеваний тканей, а также индуцируются в процессе производства и потребления белоксодержащих материалов и продуктов питания.
Долголетие и биологическая ценность белков во многом обусловлены их структурой. Белки – это крупные биомолекулы, построенные из линейных последовательностей аминокислот, свёрнутых в сложные трёхмерные структуры. 20 стандартных аминокислот, каждая из которых образована вокруг центрального атома углерода, содержат карбоксильную и аминогруппу, которые образуют пептидные связи, связывающие аминокислоты в белки, а также R-группу, которая различается у разных аминокислот и придаёт им различные химические свойства. R-группы химически разнообразны и состоят из положительно заряженных, отрицательно заряженных, полярных и неполярных групп, которые могут быть небольшими, большими или иметь ограниченную структуру. Последовательность аминокислот, составляющих первичную структуру белка, кодируется ДНК, которая затем транскрибируется в РНК и транслируется в белки с помощью тринуклеотидных кодонов для каждой аминокислоты. Поскольку белки происходят из генетического кода, все из них сохраняют часть наследуемого генетического сигнала организма, а, следовательно, белковые последовательности могут быть использованы для таксономической идентификации и реконструкции.
Цель палеопротеомики — извлечь, идентифицировать и изучить эти белки спустя долгое время после их естественного существования, и, как правило, после того, как они подверглись значительным изменениям под воздействием различных сил на протяжении столетий, тысячелетий или даже миллионов лет. Долговечность этих компонентов, в сочетании с их биологической повсеместностью и разнообразием, делает их идеальными объектами для изучения далёкого и недавнего прошлого. Таким образом, они представляют собой один из наших самых мощных инструментов для реконструкции биологической и культурной истории.
За исключением в основном экспериментальных работ, которые все ещё находятся в стадии разработки, почти все методы анализа данных масс-спектрометрии, имеющие отношение к древним белкам, основаны на использовании специализированного программного обеспечения, большой вычислительной мощности центра обработки данных, баз данных последовательностей белков или пептидных маркеров, а также на выборе априорных данных, в котором сейчас помогают алгоритмы искусственного интеллекта.
α-Кератины и роговые β-белки — это два важнейших класса структурных белков у позвоночных после коллагенов. Они являются основными компонентами волос/шерсти, ногтей/когтей, рогов, копыт, перьев, клювов, панцирей черепах, игл и китового уса. Наряду с коллагеном они присутствуют и в коже. Кератиновые ткани не минерализуются, и даже самые твёрдые ткани (например, панцири черепах, клювы, когти и т. д.) редко содержат минералы, а поэтому более подвержены деградации, чем минерализованные белки. Однако при благоприятных условиях хранения, кератины и роговые β-кератины (шерсть, волосы, перья) могут сохраняться благодаря своей гидрофобности и устойчивости ко многим протеазам, а их также находят археологи, когда они вкраплены в минеральную матрицу, образовавшуюся в результате разложения близлежащих металлических предметов (например, оружия, корон, булавок, пряжек). В настоящее время изучается возможность использования иммунологических анализов для обнаружения шерсти на металлических артефактах и в отпечатках текстиля в почве. Расширение знаний о разнообразии кератина (например, о различиях в пигментации и овечьей шерсти, связанных с одомашниванием, селекцией и рационом питания) и изменение текстуры кератина, связанное с местоположением тела, заболеванием и возрастом у людей, может позволить собрать больше информации, чем просто таксономическая классификация.
Кость и дентин имеют схожее происхождение и, соответственно, схожие, но не идентичные, протеомы. Хотя в обоих случаях доминирует структурный белок, они также содержат разнообразный набор сотен других коллагенов и неколлагеновых белков. К настоящему времени изучены древние протеомы костей человека, мамонта, моа (отряд вымерших птиц), крупного рогатого скота, лошадей, индеек, кроликов, беличьих и куньих, а также вымершего носорога. Поскольку многие коллагены имеют более высокую частоту мутаций, они являются лучшими целями для филогенетических реконструкций, особенно между близкородственными видами. Анализ протеомов костей и дентина успешно помог в определении филогенетических связей вымершей мегафауны, включая архаичных гоминидов.
Анализ на уровне протеома также может быть использован для обнаружения изменённых протеомов костей, например, тех, которые возникают в связи с изменениями уровней активности, здоровья и болезней, возраста. Изменения протеома, наблюдаемые в археологических образцах костей, могут быть результатом диагенетических факторов, а также биологического возраста, физиологического стресса, особенностей жизненного цикла и заболеваний.
Эмаль — самая твёрдая ткань в организме позвоночных. Состоящая в основном из кристаллов гидроксиапатита. Органическая матрица в зрелой эмали очень мала и составляет менее 2% от её общей массы. Но благодаря защитным свойствам, по сравнению с костью, белки эмали являются одними из самых долгоживущих в организме позвоночных. Хотя протеом эмали невелик и имеет меньшее филогенетическое разрешение, чем другие ткани (такие как кость), тем не менее, используются для успешного изучения вымерших видов. Такие образцы особенно ценны в тех случаях, когда ДНК или другие белки вряд ли выживут.
Это может показаться невероятным, но яичная скорлупа имеет гораздо большие шансы на сохранение в глубине веков, и в настоящее время именно она удерживает рекорд по старейшей успешно определённой, независимо подтверждённой пептидной последовательности — данные удалось извлечь из скорлупы страусиного яйца возрастом 3,8 млн лет из Восточной Африки. Протеомы яичной скорлупы – мощный инструмент для изучения археологических находок и более детальной интерпретации взаимодействий между людьми и птицами. Будущие исследования археологической яичной скорлупы могут дать представление о ранних методах содержания и кормления домашних птиц, таких как индейки, а также содержащихся в неволе диких птиц, подвергающихся интенсивным программам одомашнивания.
Хотя мумификация встречается сравнительно редко, она происходит в различных искусственных и естественных условиях, предоставляя редкую возможность для изучения древних мягких тканей. Наиболее часто сохраняемой и анализируемой мягкой тканью является кожа. Большинство протеомных исследований кожи (и изделий из неё, таких как пергамент) были сосредоточены только на коллагенах. Но кожа — сложная ткань с разнообразным протеомом, включающим также большое количество менее распространённых белков. Исследования человеческой кожи до настоящего времени были сосредоточены на характеристике сохранения протеома в искусственно и естественно мумифицировавшихся образцах, с акцентом на выявление белков, связанных с врождённым иммунитетом. Исследования же древних шкур осложняются неизбежной повсеместностью загрязнения белками и волосами современного человека. А интерпретация белков древних шкур требует хорошего понимания истории их раскопок и хранения, для учёта загрязнения современными включениями. Кроме того, до недавнего времени для отбора образцов древних шкур требовались деструктивные методы, которые музеи и архивы категорически не одобряли. Недавние успехи в использовании малоинвазивных плёнок EVA для взятия образцов с мумифицированных тканей и пергаментов, меняют ландшафт исследований артефактов и, вероятно, увеличат количество доступных образцов, которые можно будет проанализировать.
Помимо кожи, были также задокументированы и иногда анализировались с использованием протеомных методов другие мумифицированные мягкие ткани и органы (мышцы, ткани желудка). Ещё более удивительными является факт сохранения сотен образцов мозга, которые уже были обнаружены археологами (и, вероятно, ещё тысячи их сохранились по всему миру). Но пока только три из них прошли протеомный анализ. Количество восстановленных белков в них сильно варьируется. Успех консервации мозга, вероятно, обусловлен образованием белковых агрегатов, обеспечивающих защиту от деградации. Хотя мягкие ткани по-прежнему остаются относительно редкими по сравнению с другими типами образцов, на их основе потенциально могут быть разработаны белковые маркеры здоровья, возраста и истории жизни.
Макроостатки растений (например, семена, плоды, древесина) могут сохраняться в чрезвычайных условиях, например, в заболоченном или обугленном состоянии, а также в случаях крайней засушливости или холода. Хотя современные семена содержат белки, количество которых исчисляется от сотен до нескольких тысяч, но извлечение белка из древних семян, получается в значительно заниженной концентрации. Например, в виноградных косточках из средневекового Йорка (Англия) было идентифицировано только шесть растительных белков. Таким образом получается, что сохранность белков древних семян относительно низкая по сравнению с другими биомолекулярными классами, такими как углеводы и липиды. Но улучшение методов восстановления белков из археологических находок и недавние успехи в их идентификации, требуют возобновления усилий по анализу древних растительных протеомов из растительных макроостанков.
Микробиомы представляют собой разнообразные микробные консорциумы, образующие устойчивые сложные сообщества. Они могут быть связаны с хозяином (например, микробиомы полости рта и кишечника) или с окружающей средой (например, микробиом почвы). Образцы могут варьироваться в пределах одного участка или в пространстве (зависит от условий). Например, в полости рта микробиота дёсен отличается от микробиоты языка, которая, в свою очередь, отличается от микробиоты зубного налёта. И даже внутри одной ротовой полости существуют различия между наддесневым и поддесневым зубным налётом. Аналогичным образом, микробиота почвы существенно различается в разных условиях окружающей среды, таких как пустыни, леса и сельскохозяйственные угодья. Несмотря на эту огромную способность к разнообразию и изменчивости, а может быть, и именно благодаря ей, изучение современных и древних микробиомов представляет большую ценность.
Первый метапротеом древнего микробиома был охарактеризован на основе человеческого зубного камня — форме кальцинированного зубного налёта, который образуется естественным образом в течение жизни. Было идентифицировано множество микробных белков, включая факторы вирулентности, специфичные для пародонтальных патогенов. Результаты микробиологического анализа были улучшены, а другая специализированная база данных, созданная путём перевода метагеномных данных из тех же образцов, позволила идентифицировать ещё больше микроорганизмов. Помимо микробных белков, зубной камень также сохраняет богатый смешанный протеом слюны и жидкости десневой борозды, включая белки, участвующие в иммунологической реакции хозяина и разрушение тканей из-за заболеваний пародонта. Многие из белков хозяина, обнаруженных как в современном, так и в древнем зубном камне, экспрессируются нейтрофилами — основным типом клеток, участвующих во врождённом иммунитете пародонта.
Помимо микробных и хозяйских белков, зубной камень также содержит в разной степени пищевые белки. Первым пищевым белком, который был обнаружен в древнем зубном камне, был бета-лактоглобулин — белок, высокоспецифичный для молока. Молочные белки впоследствии были обнаружены в археологических зубных камнях европейских находок. Это способствует пониманию того, как возникло и распространялось молочное хозяйство в доисторические времена. Растительные белки также были обнаружены в зубном камне, и их количество и разнообразие постоянно росли по мере совершенствования методов и инструментов. Первое исследование по выделению растительных белков из зубного камня охватывало период от железного века до средневековья в Британии и выявило пищевые белки из овса, гороха и крестоцветных овощей только в самых молодых образцах. Последующие исследования в Леванте (времён бронзового и железного веков) выявили не только основные продукты питания, такие как пшеница и кунжут, но также специи, масличные семена и фрукты, вероятно, завезённые посредством дальней торговли. Другие пищевые белки, которые были обнаружены на сегодняшний день в археологических зубных камнях, включают овальбумин куриного яйца и гемоглобин жвачных животных.
Керамические сосуды для приготовления пищи сохраняют пищевые липиды и небольшие метаболиты (например, милиацин, винную кислоту) в течение длительного времени, что позволяет отслеживать доисторические методы приготовления пищи. Посредством анализа можно многое узнать, например, о способах приготовления рыбы, о распространении проса, молочном животноводстве, хранении растительного масла, и производстве вина. Однако попытки извлечь пищевые белки из подобных сосудов на сегодняшний день увенчались лишь ограниченным успехом. Похоже, что белки, как правило, не сохраняются в керамических изделиях, либо не могут быть из них извлечены.
В отличие от самой керамической ткани, пищевые кальцинированные корки представляют собой гораздо более перспективную цель для молекулярного анализа. Недавнее протеомное исследование 8000-летних кальцинированных отложений (накипи), образовавшихся на внутренних поверхностях кухонных сосудов из анатолийского неолитического памятника Чатал-Хююк, выявило удивительно разнообразный спектр пищевых белков, включая молочную сыворотку, творог и животные жиры, а также широкий спектр растительных белков из злаков и бобовых. Было обнаружено, что пищевые белки концентрируются именно в кальцинированных корках на внутренней стороне сосудов. Важно отметить, что это исследование показало, что древние кухонные сосуды повторно использовались для приготовления широкого спектра растительной и животной пищи, не подвергаясь мытью или сильному прокаливанию. При этом лишь немногие сосуды предполагают специализированное использование.
Помимо корок, продукты питания иногда сохранялись относительно нетронутыми в исключительных условиях окружающей среды, например, в пустыне Такла-Макан на западе Китая. Там были найдены целые окаменевшие куски сыра, украшавшие мумии, относящиеся к горизонту бронзового века. А высохшее молоко было обнаружено на внутренней поверхности корзин для сбора травы. Кроме того, с периода железного века на кладбище Субэйси сохранился заквасочный хлеб из ячменя и проса. Анализ этих замечательно сохранившихся продуктов позволил не только выявить белки, являющиеся неотъемлемой частью самого продукта, но и пролить свет на процесс ферментации этих продуктов молочнокислыми бактериями и дрожжами, что дало беспрецедентную возможность заглянуть в доисторические кулинарные технологии. Другие примеры древних продуктов, напрямую проанализированных с помощью протеомики, включают исследования содержимого кишечников необычным образом сохранившихся трупов, таких как тирольский ледяной человек Эци – альпийская ледниковая мумия, относящаяся к эпохе энеолита и «Человек из Толлунда» — исключительно хорошо сохранившееся в торфяном болоте Дании тело, относящееся к раннему железному веку.
В древности и в эпоху античности белковые материалы (например, молоко, яйца, кровь и желатин из кожи или костей) широко использовались в качестве связующих веществ для приготовления пигментов в произведениях искусства и в строительных материалах. Понимание состава этих материалов позволяет получить представление о прошлых практиках. Протеомный анализ картин позволил идентифицировать многие широко используемые связующие белки, включая казеины и бета-лактоглобулин из молока, коллагены из желатина, вителлогенины, аполипопротеины и рецептор липопротеинов низкой плотности из яичного желтка, а также овальбумин, овотрансферрин и лизоцим из яичного белка. Хотя некоторые исследования показали, что использовались связующие вещества из одного источника, многие связующие вещества состоят из смешанных источников, например, молока как минимум от двух разных видов животных или различных комбинаций молока, яиц и желатина. Помимо красок, связующие белки также добавлялись в строительные материалы, такие как растворы. Кровь и молоко часто упоминаются в качестве добавок к растворам, и их обнаруживали в древних строительных элементах с помощью различных методов. Существует множество исторически зафиксированных составов связующих веществ, но протеомика может пролить свет на использование различных рецептов при их приготовлении, поскольку они коррелируют с цветом пигмента, типом холста или статуи, свойствами и доступностью связующего вещества, а также культурным и личным выбором.
Помимо связующих веществ для красок и растворов, с помощью протеомики был проанализирован ряд других объектов исторического и археологического культурного наследия. В исторических и археологических образцах были обнаружены коллагеновые клеи, изготовленные из желатина млекопитающих и рыб. Похожим образом были проанализированы многие другие предметы, включая косметические аксессуары, нити с металлическим покрытием, органические покрытия из панциря черепах на артефактах, родовые пояса, фотографии и коллекции музейных предметов. Протеомный анализ этих предметов может помочь лучше понять знания, процессы и решения, использованные при создании материальной культуры.
